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反义RNA抑制乙肝病毒复制的临床分子生物学研究

中国急救医学2001年5月第21卷第5期

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反义RNA抑制乙肝病毒复制的临床分子生物学研究

吴赤红, 曾 争, 王勤环, 于 敏

[摘 要] 目的 研究表达反义RNA的逆转录病毒载体体外转基因抗乙肝病毒(HBV)的作用,为临床治疗乙型肝炎探索一条新途径。方法 合成互补于HBVX区(1400-1430)的X片段,互补于HBVP区(2375-2405)的P片段,分别构建表达正、反义X或P的重组逆转录病毒载体质粒PLXSN+Xpos/Ppos,PLXSN+X,PLXSN+P,转染PA317细胞,用假病毒颗粒感染2 2 15细胞后第8天,提取细胞内DNA和RNA,用荧光PCR(FQ-PCR)定量方法检测2 2 15细胞的DNA和RNA。结果 反义RNA对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA及RNA抑制作用大。结论 细胞内表达HBV反义RNA是有明显抗乙肝病毒复制和表达的作用,为将来临床应用多基因区抗乙肝病毒治疗及抗变异病治疗打下基础。

[关键词] 乙型肝炎病毒(HBV); 反义RNA; 基因治疗

[中图分类号] R312 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2001)05-0263-03lnhibitionofhepatitisBvirusbyretroviralvectorsexpressingantisenseRNA WUChi-hong,ZENGZheng,WANGQin-Huan,etal DepartmentofInfectionsDiseases,theFirstHospital,PeKingUniversity,Beijing100034,China

[Abstract] Objective ResearchontheeffectsofantisenseRNAagainstHBVinfection.Methods Retroviralvectorexpressingant-i

senseRNAcomplementarytoHBVX(1400-1430),P(2375-2405)wasusedtotransduce2.2.15cell.WeuseFQ-PCRmethodstotestce-l

luarHBVDNAandHBVRNA.Results TheresultsshowedthatthecelluarDNAandRNAinS、C、PORFsweregreatlyinhibited.Conclu-sions TheresultsdemonstratedthatretroviralvectorscontainingshorterantisensefragmentcaninhibitHBVreplicationandexpression.There-foretheantisenseRNAmaybepotentiallyusefulforanti-HBVgenetherapy.

[Keywords] HepatitisBVirus; AntisenseRNA; Genetherapy

乙肝病毒(HBV)感染是我国常见传染病,迄今尚无满意的药物或疗法治疗乙型肝炎。近年来发展起来的反义技术为治疗乙型肝炎提供了一条新途径[1,2]。本文通过构建反义RNA逆转录病毒载体,体外转基因研究其抗HBV的作用。1 材料与方法

1 1 表达反义RNA的重组逆转录病毒载体的构建和假病毒颗粒的获得。

1 1 1 重组逆转录病毒载体的构建 利用重组

[3]

DNA技术将X、P片段酶切后分别正向、反向插入PLXSN质粒的相应的酶切位点,经限制性内切酶分析、筛选,并测序鉴定正向、反向插入的重组逆转录病毒载体质粒PLXSN+X(antisense-x),PLXSN+P(antisense-p),PLXSN+Xpos/Ppos(sense-x/p)。用Lipofectinmin转染方法将上述3种质粒和空白载体质粒分别转染PA317细胞,经G418500 g/ml筛选培养后,收获含假病毒颗粒的细胞培养上清存-70 备用(分子克隆所用各种工具酶购于Promega公司,Lipofectinmin转染试剂盒、G418、DMEM、MEM和胎牛血清均购于GIBCO公司)。1 1 2 假病毒颗粒感染2 2 15细胞 将2 2 15细

4

胞以每孔1 10接种于24孔细胞培养板上,分为5组,每组设9个平行孔。第1~4组分别为PLXSN、PLXSN+Xpos/Ppos、PLXSN+X、PLXSN+P,第5组为2 2 15细胞空白对照组(Blank)。以感染倍数16:1的比例,分别加入相应量的假病毒颗粒上清,置37 、5%CO2孵箱中培养。(细胞MEM培养液含10%灭活胎牛血清,0 3%谷氨酰胺,G418200 g/ml,100U/ml青霉素和100 g/ml链霉素)。

[基金项目] 国家自然科学基金资助(No39700125)

[作者单位] 北京大学第一医院感染疾病科,北京 100034

1 2 荧光PCR(FQ-PCR)方法定量检测2 2 15细胞的DNA和RNA 假病毒颗粒感染2 2 15细胞后第8天,提取细胞内DNA和RNA,具体方法见参考文献[4]。荧光染料掺入法[5]定量检测2 2 15细胞内DNA和RNA。细胞内RNA定量PCR先逆转录

[3]

(具体方法参照分子克隆),逆转录后取10 lcD-NA用于扩增PCR。细胞内DNA定量直接扩增PCR。PCR反应总体积50 l,按下列反应条件扩增:S区按93 60S,52 1 30S,72 120S扩增;P区按93 60S,48 4 30S,72 120S扩增;C区按93 60S,51 5 30S,72 120S扩增;X区按93 60S,55 1 30S,72 120S扩增;PreS1区按93 60S,53 8 30S,72 120S扩增,共做40个循环,反应结束后,由电脑自动分析计算出定量结果。上述引物由中科院微生物所合成纯化。PCR仪为PE5700荧光定量仪(PerkinElmer)。荧光染料SYBR-Green(PerkinElmer)。

细胞内HBVDNA或HBVRNA抑制率=

空白对照孔HBVDNA或HBVRNA拷贝数-实验孔HBVDNA或HBVRNA拷贝数

空白对照组HBVDNA或HBVRNA拷贝数

100%

1 3 MTT法检测假病毒颗粒对2 2 15细胞毒性

假病毒颗粒感染2 2 15细胞后第9天,按文献[6]方法进行MTT细胞毒实验。1 4 统计处理 各组数据以 x s,多组资料用秩和检验处理,两组资料用t检验。2 结果

2 1 反义RNA对2 2 15细胞内HBVDNA的影响

第8天时反义RNA组具有明显抑制作用,正义RNA组无明显抑制作用。见表1和表2。

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关键词:(临床分子生物学,乙肝病毒复制,分子生物学研究,反义抑制,复制临床,抑制乙肝病毒)

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